科研进展

基于LC-MS/MS的靶向代谢组学的应用研究 | 挖掘重症病毒性肺炎预警诊断的潜在生物标志物

2022-12-06493

近日,广州呼吸健康研究院、实验室、广州市传染性疾病临床快速诊断与预警重点实验室联合南方医科大学附属东莞医院和金域医学广州金域质谱临床检测中心开展研合作,建立一种采用液相色谱-串联质谱联用技术(LC-MS/MS)同时对血清中花生四烯酸三大代谢通路的25种类二十烷酸进行定量检测的方法,并通过基于LC-MS/MS的靶向代谢组学研究不同感染源的重症肺炎与花生四烯酸代谢通路的相关性,以期挖掘潜在的重症病毒性肺炎预警的诊断生物标志物。成果发表于国际期刊《Analytical and Bioanalytical Chemistry》(IF 4.478)。

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近年来由SARS、 H1N1、H7N9、H5N6以及最新的COVID-19病毒引起的疾病在全球范围类散发、群发、爆发,多数患者病情进展迅速,短时间内即可发展为急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS),出现严重的呼吸、循环衰竭等症状,具较高病死率(平均30%以上)。研究表明机体免疫防御系统的过度应激和大量炎症因子的分泌,出现“细胞因子风暴”,是引发重症肺炎的主要危险因素。“细胞因子风暴”是轻症向重症和危重症转换的一个分水岭,同时也是现在重症和危重症死亡的一个原因。提前预测或及时检测细胞因子风暴的到来,对于治疗细胞因子风暴引起的重症肺炎至关重要。

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如图所示的肺泡,过度活跃的免疫反应,也称细胞因子风暴,已被认为是COVID-19死亡的主要原因。图源:Drug Discovery Today. Volume 27, Issue 2, February 2022, Pages 390-400

目前用于诊断感染性疾病中常见检测指标,如C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、白介素6(IL-6)等,对于重症病毒性肺炎的诊断和病情严重程度判断特异性不高。花生四烯酸(Arachidonic acid,AA),是一种ω-6多不饱和脂肪酸,机体在炎症反应发生时,细胞膜的磷脂池中释放出来。花生四烯酸在代谢酶的作用下,经过环氧化酶(COX)、脂氧合酶(LOX)和细胞色素 P450(CYP450)三大代谢途径转变为具有生物活性的类二十烷酸(eicosanoids)。类二十烷酸在许多疾病,特别是呼吸系统疾病和癌症的病理生理过程中起着重要的作用。既往研究表明AA代谢通路与炎症反应密切相关,从AA代谢途径中寻找过度炎症反应的潜在生物标志物,对于探究其调控作用和疾病发病机制具有重要意义。

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花生四烯酸转变为类二十烷酸的代谢途径。

图源:Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3683

对于重症流感肺炎和重度细菌性肺炎而言,目前尚未有明确的基于类二十烷酸的差异指标,找到差异指标将有助于更准确地诊断肺炎的病因,评估监控病程进展。本研究通过靶向代谢组学手段,分析健康人、流感病毒或细菌引起过度炎症反应的重症肺炎患者血清中花生四烯酸不同的特征代谢物谱,有助于区分不同病源体导致的重症肺炎。

由于生物样本中的类二十烷酸浓度差别可达几个数量级,不同类型的化合物之间的理化性质差异大,同分异构体多,同时进行多成分绝对定量分析存在很大的挑战。团队建立的LC-MS/MS检测方法,采用SPE法进行样品前处理,动态MRM监测模式,正、负离子连续切换模式等技术方案,使检测方法灵敏度高、准确性和可重复性佳,可确保花生四烯酸代谢通路靶向代谢组学研究获得精准可靠的定量数据。

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图1. 25种类二十烷酸的提取离子流图

通过OPLS-DA分析,健康组、重症流感肺炎组和重度细菌性肺炎组之间存在明显的AA代谢差异表达模式(图 2)。与健康个体相比,流感重症肺炎患者血清中的20-HETE、14、15-EET和11、12-EET的浓度升高,而LTB4的浓度降低。重症细菌性肺炎患者的8-HETE和5-HETE的浓度均表达上调,而LTE4的浓度则表达下调。在所有代谢物中,TXB2在流感或细菌诱导的重症肺炎患者中均表达下调(图3)。本研究结果与Pernet团队发表的模型小鼠LTB4缺陷小鼠更容易发生严重的流感感染结论一致。另外,进行了类似研究的Schultz等人发现,在流感感染后一天,小鼠肺部的20-HETE浓度增加,而在细菌感染的小鼠中没有显著差异。

研究通过建立一种稳定、可靠和灵敏的检测AA代谢物的UPLC-MS/MS方法,可同时定量人血清中的25种类二十烷酸,采用靶向代谢组学手段揭示了重症肺炎患者体内涉及发生“炎症风暴”的促炎和抗炎脂质介质,为更好的理解微生物感染期间宿主的反应提供了一个额外的参数支持。

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图2 健康组、H1N1或细菌引起的重症肺炎患者的血清样本数据OPLS-DA分析

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图3 健康组、重症病毒性肺炎组和重症细菌性肺炎组血清样本中8种显著改变的代谢物的散点图

实验室、广州市传染性疾病临床快速诊断与预警重点实验室杨子峰教授联合南方医科大学附属东莞医院东莞市呼吸和重症医学研究所学科主任沈利汉主任和金域质谱临床检测中心开展科研合作。杨子峰教授团队致力于呼吸道病毒的诊断和防治研究,充分发挥基础和临床结合,利用病毒、药理及临床等多学科交叉,在流感病毒和细菌共感染研究方向不断探索,并取得重要成果。东莞市呼吸和重症医学研究所为集临床、教学和科研于一体的重症医学中心,被指定为广东省和东莞市重型和危重型新冠病例定点收治单位。

本次合作项目通过基于液相质谱联用技术的代谢组学手段挖掘潜在生物标志物,后续通过分子生物学手段对潜在生物标志物进行验证,研究潜在生物标志物对病毒性感染导致的过度炎症反应的调控作用,以期获得可以准确评价临床 ALI/ARDS 发生发展程度的系统指标,提高病毒性重症肺炎病例的诊断、预警及防治成功率。


论文原文:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36344666/