（一）研究背景

传统的方法不能快速直观地反映流感病毒在细胞及动物体内的复制，国际同行过去20多年来一直尝试于制备携带报告基因的流感病毒但不成功。当面临流感大流行疫情时，我国需要有能迅速制备出新的流感疫苗株以利尽早防备（而不仅是依赖国外/WHO 提供的疫苗株），在短时间内生产出能供大量人群使用的疫苗也至关重要。因此流感疫苗候选株的制备、疫苗产量和抗原含量是我国应对新流感病毒爆发的重大需求。腺病毒也是引起呼吸道感染的常见病毒，在人类已知有约50多种。由于有些病毒培养困难及生物安全等原因，亟待发展新型的疫苗制备策略。腺病毒Ad2,Ad5已被广泛应用为基因治疗和疫苗的载体，但因为人群中普遍存在中和抗体而阻碍了腺病毒载体的应用，如何提高腺病毒载体的效果也是亟待解决的难题。

（二）创新性成果

1. 基于反向遗传技术的流感病毒改造及疫苗株制备

我们通过建立新型流感病毒反向遗传操作系统，克服了流感病毒基因组容量小兼容性差等难点，制备出可复制携带绿色荧光蛋白（eGFP）的重组流感病毒（J Virol, 2012）。可快速、直观的评估抗病毒药物、抗体的效果。随后又构建了携带荧光素酶的流感病毒(Nat Commun，2013)，可以通过检测肺部发光对同一实验动物体内的病毒复制进行连续、实时的活体动态监测。可视性报告流感病毒推动了流感病毒致病机制研究、新型抗流感药物筛选与流感疫苗效果评估。这两篇论文发表后收到了国内外研究院校及跨国制药企业强生、默克等来函要求合作。

2013年初在我国发生了H7N9禽流感，当时防控形势严峻，H7N9流感疫苗是否能够诱导机体产生抗体用以对抗病毒的感染？在获得H7N9病毒基因信息后，利用反向遗传技术仅用12天就独立自主构建了H7N9重组病毒疫苗株。证实该疫小鼠免受致死剂量H7N9病毒攻击，提示H7N9康复者血浆可以用于治疗H7N9感染患者（Antiviral Res,2014），显示了我国有能力自主制备禽流感疫苗种子株 (注：我国香港大学的研究人员也同时构建出了H7N9重组病毒疫苗株）。世界卫生组织推荐使用H5N1流感疫苗株NIBRG-14在生产中发现该疫苗株的HA抗原产量低。我们通过在H5N1重组疫苗株 NA基因两端嵌合包装信号序列的方法，提高了疫苗病毒株的包装效率，使其在鸡胚的生长滴度提高了10倍。本研究成果为H5N1及其他亚型流感疫苗株的研制提供了新的方向(Hum Vaccin Immunother, 2012)。

插图1：荧光流感病毒感染小鼠的肺部照片（Nat Commun，2013）小鼠经鼻感染“荧光流感病毒”，两天后用成像仪在病毒感染区域，即鼻咽和肺部可检测到病毒引起的发光

2. 新型腺病毒载体疫苗设计与及效果提升

在腺病毒壳体六邻体蛋白中插入一个外源抗原表位，则每个腺病毒就可以展现720个抗原表位，使目标抗原表位展露在病毒粒子的表面上可有效地起到疫苗的作用。基于该理论，我们发展出一种基于人3型腺病毒（Ad3）衣壳表位展示载体平台，具有强免疫原性不需要进行转基因表达等优点，，我们利用该展示载体制备了多种候选新疫苗，构建了能诱导产生抗多亚型腺病毒中和抗体的重组病毒株（J Virol, 2012，Viruses 2015, Vaccine 2015)。我们以Ad2为载体构建了以中国HIV流行株为目标的新型腺病毒载体艾滋病疫苗，通过与痘病毒载体疫苗联合使用，在猕猴取得了不亚于国际同行最好的保护效果（J Virol, 2012, 2013）。该疫苗已完成中试生产，正在进行临床前安全评估，准备申请临床试验。虽然腺病毒载体能携带目标抗原诱导机体产生特异免疫应答，但人群中普遍存在的中和抗体可抑制腺病毒载体疫苗的效果。我们探索了用外周血单核细胞作为“胶囊”保护输送腺病毒载体，发明了一种使腺病毒载体疫苗更有效地诱导免疫反应的新方法（Vaccine. 2011，J Virol. 2012）。最近又与材料学专家交叉合作，将自然界中广泛存在的生物矿化(biomineralization)现象应用于修饰和提升疫苗的性能，证明了磷酸钙盐在一定条件下可在腺病毒表面形成一层矿化薄膜，犹如给病毒添加了一层“蛋壳”。该技术可避免腺病毒载体疫苗被抗体中和，激发出更有效的抗病毒多功能性细胞免疫应答，显著地提高了疫苗的免疫效果（Adv Mater, 2015）。 

插图2：生物矿化现象应用于修饰和提升疫苗的性能（Adv Mater. 2015）

（三）国内外影响及评价

1、日本Yoshihiro Kawaoka教授 (流感领域权威专家)在Virus Res (2011年162卷1期) 综述评论了李锋等 (Li et al. J Virol. 2010)的携带GFP的报告流感病毒，肯定了研究中的方法能够使流感病毒有效表达报告基因。

2、美国杜克大学的Nicholas S. Heaton教授在J Virol. (2015年89卷23期)的论著中引用评述潘蔚绮等（Pan et al., Nat Commun. 3、的研究成果，认为“荧光报告病毒的研究对流感病毒致病机理、抗病毒化合物筛选及抗体效果评估很有帮助”。

3、国罗切斯特大学的Luis Martínez Sobrido教授在PlosOne (2016年1期)的论著中评论潘蔚绮等（Pan et al., Nat Commun. 2013）的研究成果，认为“荧光报告病毒是体内外定位及定量病毒复制的有力工具”。

4国阿拉巴马州大学的Qiana L Matthews教授来信申请合作将我们的重组腺病毒载体用于“以腺病毒为载体的新型锥虫病疫苗研究”及“下一代腺病毒载体为基础的新型黏膜HIV疫苗”。Qiana L Matthews教授在2013年出版的著作Novel Gene Therapy Approaches第五章Viral Vectors for Vaccine Development，及2014年出版的著作 Novel Technologies for Vaccine Development第八章Adenovirus-Based Vectors for the Development of Prophylactic and Therapeutic Vaccines中以较大篇幅评论田新贵等（Virus Res. 2011）构建的rAd3H7载体，肯定了该载体在疫苗研究中的应用前景。

5、英国格拉斯哥大学Estrella Lopez-Gordo教授在其论著Hum Gene Ther（2014年25卷4月期）中评论了论田新贵等（Virus Res. 2011）构建的rAd3H7载体，肯定了该载体在基因治疗研究中的应用前景。

6本Masaaki Kawano 教授在Expert Rev Vaccines（ 2013年12卷2期）中综述评论了孙彩军 （Sun et al., J Virol. 2012）的研究成果，认为“这种策略有助于他们研发的SV40-VLP作为疫苗递送系统产生有效的粘膜免疫”。

7、美国加州大学圣地亚哥分校Che-Ming J. H教授在Nature Nanotechnology(2013年8卷12期)的论著中引用评述孙彩军等（Sun et al., J Virol. 2012）的提升腺病毒载体克服中和抗体的AVIP策略，旁证了他们研制的纳米颗粒细菌毒素疫苗的工作原理。

8、美国Christopher L. Parks，C. Richter King和 Louis J. Picker（艾滋病研究领域的最权威专家之一）教授在Current Opinion of HIV AIDS（2013年8卷5期）撰文述评孙彩军等（Sun et al., J Virol. 2013）的腺病毒载体艾滋疫苗研究成果，他们认为“值得着重说明地是，利用天坛痘病毒载体和腺病毒载体疫苗联合免疫策略在中国猕猴/SIV感染模型中起到了显著的保护作用” 。

9、法国Ste′phane Paul教授等在AIDS（2014年28卷12期）撰文述评孙彩军等（Sun et al., J Virol. 2013）的研究结果，认为“这种联合免疫策略诱发的抗原特异CD8+T细胞控制了SIV病毒的粘膜感染”。

10、跨国药企强生（Johnson & Johnson）, 默克(Merck)来函及电话会议要求在潘蔚绮等（Pan et al., Nat Commun. 2013）的荧光流感病毒方面合作。